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          基礎知識:福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA提取

          來源:深圳市安必勝科技有限公司 轉載請注明出處【字號:

          本篇文章是關于一個我們很少被問問題的題目,因為太簡單,方法很常規結果也很少出錯。我想說的是:福爾馬林固定石蠟包埋組織的DNA提取。

          什么是FFPE組織?

          FFPE指的是為維持細胞核蛋白結構,先用福爾馬林固定然后固體石蠟包埋,以便使用超薄切片機切成5-10微米厚的薄片的組織樣品(通常是疑似腫瘤組織)。福爾馬林與蛋白氨基發生了不可逆交聯,保護細胞結構完整性,染色顯示組織中腫瘤帶來的畸形結構。但是,固定劑的交聯作用對核酸來說是有害的。福爾馬林石蠟和交聯作用還妨礙了核酸的提取,抑制脫氧核糖核酸聚合酶、PCR擴增,都必須去除。

          從這些樣品中獲取DNA的前景看似很暗淡。幸運的是,我們已經客服了這兩種主要障礙,從FFPE組織中獲得高質量DNA不再困難。

          石蠟如何去除?

          傳統去除石蠟的方法通常是使用二甲苯,一種高度易燃的有機溶劑。組織切片用二甲苯反復沖洗數次溶解石蠟,然后在DNA提取前再用乙醇反復沖洗去除殘余二甲苯。如此反復多次的沖洗步驟,每次都會有少量組織隨著石蠟和有機溶劑被沖洗掉。

          另一種方法是使用無毒的BiOstic Paraffin Removal Reagent(貨號:12251-50)。它跟二甲苯一樣好用,并且安全,可生物降解。

          不去石蠟,還能獲得高得率DNA嗎?

          我很高興你問到這個問題。是的,能。如果你有辦法提高蛋白酶K的活性使其能夠穿透石蠟發揮消化功能,那就沒必要非得先去掉石蠟了。減少了處理時間又能避免組織損失。

          為了達到這個效果,我們推出了一對溶液組合,可制造強變性環境,高溫狀態下提高蛋白酶K的活性,在石蠟溶解的同時完成組織的消化。如果你有用過BiOstic FFPE Tissue DNA Kit,你就知道他們分別是FP1和FP2溶液。這兩種溶液的協同作用使遠高于標準蛋白酶K消化緩沖液的活性效果,使獲得如下圖所示的高得率DNA。在這個例子(由一客戶提供)里,每樣加入了一塊從組織學幻燈片中去除的10微米厚切片。藍色的樣品先用二甲苯預處理,DNA提取按照廠家的操作說明執行,而BiOStic樣品則無需石蠟去除步驟就直接進行提取。用分光光度法檢測得率。如你所見,每片1-2微克的樣品得率從0.5-10μg不等。沒有一個個切片結果相近。

          DNA分子量什么情況?

          DNA的分子量很大程度上受固定處理方法和固定的時間影響。也會受組織本身年齡限制。通常分子量很小,大概100-500bp。你能看到,通過避免使用有機溶劑和額外的處理步驟,可減少DNA的進一步損壞和丟失(注意圖中M標條帶,不用二甲苯處理)。因為只有做完整個提取才能知道DNA的情況,我們通常建議使用專門為最小擴增子而設計的qPCR法檢測。在右邊的例子中,分析法專門針對人類GAPDH基因,擴增子大小是70bp。

          能提取到FFPE組織的RNA嗎?

          很顯然,這類樣品的RNA降解會非常嚴重。他們并非是在RNase-free的環境下制作的,而且組織樣品可能已經在室溫下的櫥柜里存放多年。 但我們還是有方法提取FFPE組織中的RNA,并獲得寶貴數據。 通過對幾處操作步驟的略微改動,我們能用BiOstic FFPE DNA Isolation Kit提取到RNA。FP1和FP2組合對于RNA來說太強烈,所以我們用對RNA更溫和的中性溶液BF2(貨號:24000-50-2)。提取DNA時為去除蛋白質交聯而做的90℃孵育步驟不能做了。在Masuda et. al., 發表的一片文章(Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples, Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, No. 22, pages 4436-4443)中,使用了溫度梯度法來確定RNA提取過程中哪個溫度以及多長時間的孵育,能既去除掉蛋白交聯也能成功進行RT-PCR。他們發現,70℃ 30min能足夠完成這項工作。

          如果你對我們的FFPE DNA kit或RNA提取步驟感興趣,請告訴我們。我們會給你試用裝。

          總結

          FFPE組織這種獨特的樣品類型有許多挑戰,我們已經使得DNA提取部分變得相當容易。

          使用 BiOstic FFPE DNA Tissue Kit最近發布的參考文獻:

          Shawn E. Yost, Erin N. Smith, Richard B. Schwab, Lei Bao, HyunChul Jung, Xiaoyun Wang, Emile Voest, John P. Pierce, Karen Messer, Barbara A. Parker, Olivier Harismendy, and Kelly A. Frazer. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 1–12 (2012).
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