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          科研小技巧:分光光度法與熒光染色法在定量檢測DNA應用中的區別

          作者:Suzanne 來(lái)源:美國MoBio實(shí)驗室【字號:

          今天我準備討論一種可能在你整個(gè)科研生涯中一直都在用的常規方法。它是如此的基本、簡(jiǎn)單,你可能根本沒(méi)在意。但我希望你在睡覺(jué)前能稍微想它一下。我要說(shuō)的是什么?當然是質(zhì)粒提取。

          質(zhì)粒DNA提取作為實(shí)驗室常規實(shí)驗,你肯定很希望就算提取過(guò)程出錯了,依然能回收到DNA。但是,你回收到的真的僅僅是DNA嗎?事實(shí)上質(zhì)粒提取是對兩種定量檢測DNA方法最有效的驗證:分光光度法 VS. 熒光染色法(Picogreen)。

          像大多數實(shí)驗室一樣,我們也用分光光度法定量檢測核酸。分光光度法簡(jiǎn)單、靈敏,無(wú)需標準曲線(xiàn)。但是,當我們用分光光度法和Picogreen法定量檢測我們的質(zhì)粒提取試劑盒與其它品牌質(zhì)粒提取的質(zhì)粒時(shí),結果令人吃驚。再深入探討前,我們需要了解…

          質(zhì)粒DNA提取作為現在最常規的實(shí)驗,你可能希望就算提取過(guò)程中盡管犯了點(diǎn)小錯,DNA還是能要回來(lái)。但是,你要回來(lái)的真的只有DNA嗎?碰巧的是,質(zhì)粒提取是區分兩種DNA定量檢測方法之間區別的最好范例:分光光度法 VS. 熒光染色法(Picogreen)。

          在我們實(shí)驗室,我們也用分光光度法定量檢測核酸。它簡(jiǎn)單、靈敏且不需要標準曲線(xiàn)。但是,當我們用分光光度法和Picogreen法比較提取的質(zhì)粒的定量檢測結果時(shí),對于我們的質(zhì)粒提取試劑盒和競爭對手的盒子,結果非常驚訝。在我們做進(jìn)一步分析前先了解一下Picogreen。

          什么是Picogreen?

          Picogreen是一種熒光染料,與雙鏈DNA特異結合后,能在485/530nm波段發(fā)出熒光?捎脽晒夥治鰞x或Qubit定量檢測樣品中的DNA含量。常用的分光光度法檢測260nm(A260)處的吸光值,缺點(diǎn)是光不能區分DNA和RNA、鹽、染色劑等雜質(zhì) 是獲知含RNA的DNA樣品準確濃度的非常有用的工具。

          跟質(zhì)粒制備有什么關(guān)系?

          還記得你加入到Tris重懸浮液的RNase嗎?它是用于消化為制備質(zhì)粒而培養的健康的處于對數生長(cháng)期的大腸桿菌中大量存在的RNA。然后,理想情況下,消化了的RNA從硅膠離心柱上洗掉,你只獲得高純度DNA。

          讓我們吃驚的是質(zhì)粒DNA中有大量RNA污染。見(jiàn)下面的例子。使用瓊脂糖凝膠電泳,電泳中清晰看到RNA雜質(zhì)的模糊條帶。

          *競爭品牌試劑盒需要需要在提取前往重懸緩沖液加入RNase A,MOBIO的試劑盒不需要

          但是,分光光度計中RNA雜質(zhì)并不能像picrogreen那樣清楚顯示。

          如果你只用分光光度計檢測DNA,以及競爭對手的試劑盒,你肯定會(huì )覺(jué)得前面的試劑盒更好。凝膠上顯示他們得率是差不多的,但是分光光度計讀數讓你認為有雙倍的DNA。

          但是,picogreen卻給出了不一樣的結果。當有RNA存在的時(shí)候,原來(lái)2-3倍的假得率顯現了真實(shí)得率。使用MOBIO試劑盒,分光光度法得到的結果更接近實(shí)際得率。

          有何意義?

          這意味著(zhù)當你酶消化樣品準備做克隆或寄送質(zhì)粒用于測序前,你能準確地知道實(shí)際上有多少DNA。在對克隆結果排疑或者準確計算質(zhì)粒插入率都有很大幫助。

          我知道并不是每個(gè)人都能用Picogreen檢測他們的DNA。而且并不都一定要知道準確的DNA量。我們也不常用這個(gè)方法,說(shuō)實(shí)在的。只是請注意,當你看到質(zhì)粒DNA凝膠底部有個(gè)模糊的條帶,你的質(zhì)粒得率可能只有測量值的一半,做好相應的計劃準備即可;蛘咴囉肕OBIO的Plasmid DNA kit,你就是再也不用擔心了。

          我們也知道同樣的問(wèn)題也會(huì )存在于基因組DNA的制備。我們的的建議是什么?至少用兩種方法檢驗DNA質(zhì)量:瓊脂凝膠和分光光度法或picogreen。事實(shí)上只用一種辦法很難給你足夠信息確保下游實(shí)驗能是否成功進(jìn)行。

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