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          DNA得率有問(wèn)題?

          作者:Michelle Tetreault Carlson 來(lái)源:美國MoBio實(shí)驗室【字號:

          DNA的得率問(wèn)題排在MOBIO收到的技術(shù)咨詢(xún)前五位。沉積物、棉拭子、廢水活性污泥等我們都聽(tīng)說(shuō)過(guò)未能提取到足夠DNA。畢竟DNA沒(méi)人會(huì )嫌多。

          當有人告訴我們他們沒(méi)能獲得足夠DNA的時(shí)候,我們首先排除一些常見(jiàn)的錯誤。比如因未能理解某個(gè)操作步驟而做錯了,或者選擇了一個(gè)不合適的試劑盒。也有可能是因為實(shí)驗室同事留給你的樣品在室溫下過(guò)夜卻沒(méi)有告訴你,諸如此類(lèi)的原因可以列出很多很多。然而,真正的原因有可能很簡(jiǎn)單,因為DNA得率低(這里說(shuō)的低得率指的是低于用分光光度計,比如Nanodrop,檢測下限的濃度濃度)并不一定意味著(zhù)操作過(guò)程出了錯,有可能一開(kāi)始樣品中就沒(méi)有多少核酸,這種情況在棉拭子、濾膜和沉積物等生物含量較少的樣品中很常見(jiàn)。

          當你著(zhù)手研究一個(gè)從未做過(guò)的樣品,你可能不太知道微生物的類(lèi)型和微生物含量,因此也會(huì )不確定預期得率能有多少,尤其是野外采集的環(huán)境樣品。例如,每種土壤都有不同的pH、腐植酸含量、含碳量等。幸運的是,你并不需要摸黑前進(jìn),只要做一個(gè)對照即可。DNA yield2

          對于土壤樣本,最好陽(yáng)性對照就是加入一定數量的細菌或者真菌到樣品中,然后嚴格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)做一次。細菌或真菌樣品可以自行過(guò)夜孵育制備。最好選擇希望在樣品中找到的代表性微生物。然后取1-2毫升培養物離心收集細胞。像大腸桿菌,1毫升過(guò)夜培養物大概含有10^9個(gè)細胞,能提取到約5微克DNA。真菌的細胞DNA含量大約是細菌的10倍。查查你實(shí)驗對象的基因組大小,測量一下培養物的細胞密度并對DNA的得率做出預估。然后,離心培養物收集細胞沉淀并用少量的中性緩沖液重懸,比如100μl生理鹽水,將重懸液混入土壤樣品中并在開(kāi)始提取前至少孵育10分鐘。與此同時(shí)平行提取你的原始樣品。這樣從標準化的和沒(méi)有標準化的樣品之間的濃度差就可以判定樣品中含有多少DNA,如果行不通,可能是土壤中含有金屬等雜質(zhì)干擾了樣本處理或者勻化不充分導致細胞裂解不完全等原因造成的。如果仍然搞不定,請聯(lián)系MO BIO的技術(shù)支持。

          其它樣本也可以做類(lèi)似的標準化實(shí)驗,按你的標準將純培養物和處理樣本結合起來(lái)就行,例如,你正在過(guò)濾的池水,可以先用純培養的微生物標準化,再按既定的方法過(guò)濾處理樣本,這樣的話(huà)可以保證DNA提取方法是沒(méi)有問(wèn)題的,測出樣品的濃度,又消除了一個(gè)未知因素。事實(shí)上,哪怕你對目前的提取方法已經(jīng)很熟練了,也最好每次實(shí)驗都做這樣一個(gè)對照,這只需在試驗前期花費很少的時(shí)間,就很可能為你的下游實(shí)驗節省許多工作量。

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